dnpshop

[uwasyc]

<br> Новый метод, пригодный для скрининга лекарств. Данный метод подходит для тестирования воздействия веществ на митохондрии, в частности, для тестирования токсического или полезного действия лекарственных соединений или кандидатов в лекарственные препараты. Данный метод ориентирован на проведение измерений ex vivo в митохондриях человеческого организма, но в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Метод также подходит для исследования влияния веществ на митохондриальное дыхание. Указанный метод применим для i) скрининга и проведения отбора на начальной или поздней стадии исследования кандидатов в лекарственные препараты на клеточном уровне, выделенных из организма здоровых людей, или в так называемом лейкотрофоцитарном слое, содержащем концентрированный раствор тромбоцитов и палевых клеток крови, ii) исследования чувствительности человека к известному митохондриальному токсиканту, iii) анализа митохондриальной токсичности стройным персоналом в соответствии с медицинскими экспериментами и/или iv) анализа благоприятного воздействия лекарственных препаратов, предназначенных для улучшения митохондриальной функции.<br>2420-523147ea/030 скрининг на митохондриальную токсичностьисследование техники, к которой относится изобретение настоящее изобретение относится к новому методу, который подходит для скрининга лекарственных средств. А именно, данный метод подходит для тестирования воздействия веществ на митохондрии, в частности, для тестирования токсического или положительного воздействия лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства. Данный метод основан на измерениях ex vivo в спорулированных митохондриях человека, которые, однако, значительно приближены к условиям in vivo. Данный метод также подходит для исследования влияния веществ на митохондриальное дыхание. В последние годы некоторые из новых препаратов, одобренных fda, впоследствии были отозваны из-за токсических эффектов, таких как кардио- или гепатотоксичность. Так, из новых препаратов, одобренных fda в период с 1994 по 2006 год, 38 препаратов были отозваны из-за токсических манипуляций с печенью и сердцем, что считается типичным симптомом митохондриальной токсичности. Безусловно, эти новые препараты перед одобрением проходили стандартные испытания на токсичность, а токсические эффекты наблюдались только после использования препаратов в лечении чрезмерного количества пациентов. Как отмечают dykens & will (2007), данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция сыграла определенную роль в определении токсичности различных препаратов, которые были отозваны с рынка и возвращены на него только со строгими ограничениями. Кроме того, функция митохондрий в последние годы вызывает большой интерес, и принято считать, что митохондриальная дисфункция является важным фактором в патогенезе большого числа заболеваний (таких, например, как мышечные повреждения, нейропатия, кардиомиопатия, энцефалопатия, полиорганная недостаточность, вызванная сепсисом). В настоящее время митохондриальная токсичность кандидатов в лекарственные препараты оценивается в основном на животных и клеточных культурах, и полученные результаты трудно перенести на будущее применение препаратов для человека. Таким образом, существует необходимость в разработке чувствительного, воспроизводимого, надежного и простого теста митохондриальной токсичности, который можно было бы использовать для тестирования при разработке лекарственных препаратов. Описание объекта изобретения настоящее изобретение преимуществом разработанного метода является определение токсичности лекарственного средства (или положительного эффекта лекарственного средства) в живых митохондриях человека ex vivo, но в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Компоненты крови человека, содержащие митохондрии (лейкоциты и/или тромбоциты), исследуются в плазме, что обеспечивает условия, очень близкие к условиям in vivo. Таким образом, учитываются все факторы, такие как буферная емкость, сывороточный альбумин, электролиты, гидролизующие ферменты и т.Д. Новый метод позволяет напрямую оценить токсические концентрации в крови человека, что невозможно при исследовании на клеточных культурах или животных, которые используются в настоящее время. Таким образом, скрининг и исследование лекарственных препаратов на токсичность для человека можно проводить на гораздо более ранних стадиях, чем это возможно в настоящее время. В свою очередь, данный метод позволит отсеивать токсичные лекарственные кандидаты на более ранних стадиях, избегая тем самым многочисленных испытаний на животных и болезненных последствий для человека в будущем. Данный метод будет способствовать скринингу лекарственных кандидатов на более ранней стадии, тем самым сокращая общее время и стоимость разработки лекарственных препаратов. Данный метод может быть использован с различными параметрами установки и с изменением параметров установки в зависимости от целей метода. Таким образом, не ограничивая область применения, метод согласно настоящему изобретению может быть использован для: 1. Скрининга и проведения ранней или поздней стадии отбора кандидатов в лекарственные препараты в клетках, выделенных из крови здоровых людей, или в так называемом лейкотрофоцитарном слое, представляющем собой концентрированный раствор тромбоцитов и лейкоцитов. 2. Исследования чувствительности пациента к известному митохондриальному токсиканту. 3. Анализа митохондриальной токсичности препарата в условиях клинического исследования. 4. Анализ благоприятного действия лекарств агентов, направленных на улучшение митохондриальной функции. Подходящий метод для скрининга и отбора потенциальных лекарств или для исследования чувствительности человека к веществу, влияющему на митохондрии (т.Е, метод согласно пунктам 1 и 2 выше), представляет собой метод, включающий: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, которые содержат живые митохондрии, выделенные из образца крови человека, ii) контакт образца клеток с веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней мембраны митохондрий по отношению к протонам, (iii) добавление тестового образца, содержащего тестовое вещество в носителе, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления тестового образца и сравнение потребления кислорода в тестовом образце с потреблением кислорода в контрольном образце носителя, где снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (v) контактирование образца из (iii) с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, с целью выявления клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, (vi) контакт образца из (v) с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как аутоксидация образца. Альтернативная методика скрининга и отбора потенциальных лекарственных средств или исследования чувствительности человека к веществу, воздействующему на митохондрии (т.Е, метод согласно пунктам 1 и 2 выше) включает в себя тестирование действия такого вещества в скрининговом анализе комплекса ii. Такой метод проиллюстрирован на фиг. 11, и включает: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, которые содержат живые митохондрии, выделенные из образца крови человека, ii) контакт образца клеток с веществом, которое ингибирует дыхание комплекса i, iii) добавление тестового образца, содержащего исследуемое вещество в носителе, iv) добавление вещества, пермеабилизирующего цитоплазматическую мембрану, v) добавление стандарта к образцу, полученному согласно пункту iv), vi) добавление вещества, ингибирующего дыхание комплекса iii. Результаты, полученные в ходе исследований, сравниваются с результатами, полученными методом, в котором используемое тестовое вещество идентично эталонному. Типичный результат представлен на фиг. 11, из которого видно, что препарат-кандидат способен проникать через цитоплазматическую мембрану в определенной степени (т.Е. Обеспечивается усиление дыхания). Добавление дигитонина, который делает цитоплазматическую мембрану проницаемой, не приводит к дальнейшему усилению дыхания, т.Е. Не усиливает действие испытуемого вещества. При добавлении эталонного вещества (субстрата, связанного с комплексом ii, например сукцината), которое обычно является эндогенным субстратом, например сукцинатом, наблюдается увеличение дыхания и достигается максимальная активность. Затем добавляют комплекс iii, например антимицин а, для определения активности, не связанной с потреблением кислорода митохондриями, например автоокисления данного образца. При сравнении с результатами для эталонного вещества, которое является эндогенным субстратом, например сукцинатом, видно, что эталонное вещество не проникает через цитоцитоплазматическую мембрану. Только при пермеабилизации мембраны, например, дигитонином, дыхание увеличивается. Дальнейшее добавление эндогенного вещества не изменяет дыхания, а добавление ингибитора комплекса iii останавливает митохондриальное дыхание. Очевидно, что картина, наблюдаемая для исследуемого вещества, может отличаться от представленной на рис. 11. Метод дает ценную информацию о том, может ли тестируемое вещество проникать через цитоплазматическую мембрану и положительно влиять на активность митохондрий, связанную с потреблением кислорода (т.Е. Увеличивать митохондриальное дыхание по комплексу ii). Таким образом, наиболее близкое к идеалу испытуемое вещество будет иметь уровень a, превышающий a’, при этом a будет приближаться к уровню b’. Более подробная информация приведена в данном описании в примерах. Другой подход заключается в изучении влияния испытуемого вещества на дыхание комплекса i, комплекса ii и/или комплекса iv. Изучение дыхания комплексов i, ii и/или iv позволяет получить более подробную информацию о влиянии конкретного вещества на митохондриальное дыхание и оценить положительное или отрицательное воздействие на митохондриальную функцию. На фиг. 14 показано влияние возрастающих концентраций метформина на митохондриальное дыхание комплексов i, ii и iv. Рисунок показывает специфическую дисфункцию дыхания комплекса i при увеличении концентрации метформина, в то время как дыхание комплексов ii и iv, по-видимому, не затрагивается. Дыхание комплекса i (oxphosci) стимулируется после добавления adp с последующим добавлением дополнительного глутамата, который является субстратом комплекса i (см. Рис. 3). Дыхание комплекса ii стимулируется при добавлении в образец клеток ингибитора комплекса i (в частности, ротенона) с последующим добавлением возрастающих количеств тестируемого вещества. Дыхание комплекса iv стимулируется при добавлении n,n,n’,n’-тетраметил-п-фенилендиамина (тмпд, 0,5 мм), донора электронов комплекса iv. В связи с высокой степенью автоокисления тмпд добавляют азид натрия (10 мм), ингибитор комплекса iv, и по разнице между двумя полученными уровнями рассчитывают удельную активность комплекса iv. Подходящий метод для исследования воздействия на митохондрии препаратов-кандидатов в клинических испытаниях или курсах лечения (т.Е. В соответствии с пунктами 3 и 4 выше) включает: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, содержащего живые митохондрии, выделенного из образца крови человека, при этом образец клеток человека получен от человека, участвующего в клиническом испытании или проходящего курс лечения, а испытуемое вещество вводится человеку в рамках клинического испытания или в соответствии с курсом лечения, (ii) контакт образца клетки с веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, (iii) сравнение потребления кислорода образца, полученного от индивидуума, участвующего в клиническом исследовании или (ii) проходящего курс лечения, (iii) сравнение потребления кислорода образца, полученного от индивидуума, участвующего в клиническом исследовании или (ii) проходящего курс лечения, с потреблением кислорода контрольного образца, полученного от контрольной группы, причем снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (iv) контакт образца, полученного согласно (iii), с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, (v) контакт образца, полученного в соответствии с (iv), с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Как видно из вышесказанного, методы по существу идентичны и отличаются только исследуемыми образцами, т.Е, т.Е. Являются ли эти образцы тестовыми веществами или образцами клеток человека, участвующего в клиническом исследовании или проходящего лечение. Человек, участвующий в клиническом исследовании или проходящий курс лечения, получает исследуемое вещество, лекарственный препарат или потенциальное лекарственное вещество в соответствии с клиническим исследованием или курсом лечения. Это означает, что митохондрии, выделенные из образца крови, взятого у такого человека, подвергаются воздействию рассматриваемого лекарственного вещества или потенциального лекарственного вещества, и, таким образом, с помощью метода настоящего описания можно наблюдать любое влияние указанного вещества на митохондриальное дыхание. Митохондриальное дыхание контролируется с помощью спирометрии. Соответствующие настройки указаны в примерах, приведенных в настоящем описании, но специалист в данной области знает, как изменить или скорректировать настройки при необходимости или в случае использования другого прибора. Образец крови может представлять собой образец венозной крови. Тромбоциты, лейкоциты или их комбинации могут быть выделены и использованы. Подходящие примеры веществ, увеличивающих проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, включают п-(трифторметокси)фенилгидразон карбонилцианид (fccp), м-хлорфенилгидразон карбонилцианид (ссср), 2,4-динитрофенол (dnp) или другие протонофоры. Дополнительные сведения о методах приведены в примерах настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения. Ниже приведены подробности описанных методов. 1 . Скрининг и выбор кандидатов на ранней и последней стадиях лекарственных препаратов в клетках, выделенных из крови здоровых людей, или в таком названии лейкотромбоцитарный слой, который является концентрированной растворкой тромбоцитов и клеток белой крови такой метод включает: i) спирометрия высокого разрешения образца клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода от 400 до 25 мкм og и постоянной температуре 37°c, ii) контакт образца клеток с веществом, увеличивающим проницаемость внутренней мембраны митохондрий по отношению к протонам, например, карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразон (fccp), карбонилцианид м- хлорфенилгидразон (ссср), 2,4-динитрофенол (dnp) или другой протонофор, для того чтобы максимально повысить активность митохондриальной системы переноса электронов, присутствующей в тромбоцитах, (iii) добавление тестового образца, содержащего тестовое вещество на носителе; добавление обычно проводят, постепенно увеличивая дозу над добавляемым носителем, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления тестового образца и сравнение потребления кислорода между тестовым веществом и носителем, причем снижение потребления кислорода указывает на отрицательное воздействие на митохондрии, (v) контакт образца, полученного в соответствии с (iii), с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, для определения клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, vi) контакт образца, полученного согласно v), с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для определения любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Снижение может быть значительным или дозозависимым. Как описано выше, образец крови человека получают от здоровых людей. Как правило, образец получают, как описано в примерах настоящего описания. Клетки обычно представляют собой тромбоциты, лейкоциты или их комбинации. Клетки могут быть суспендированы в плазме крови человека (в некоторых случаях в собственной плазме) или в водном буферном растворе, содержащем, в частности, сахарозу, hepes, k-лактобионат, хлорид магния, дигидрофосфат калия, egta и бычий сывороточный альбумин, или в других подходящих буферных растворах. Ph обычно регулируется в диапазоне от 7,0 до 7,5, в частности, доводится до 7,1. Как правило, для нативных тромбоцитов или лейкоцитов предпочтительно растворение в плазме крови, чтобы наилучшим образом имитировать ситуацию in vivo. Однако в некоторых ситуациях или в качестве дополнения к растворению в плазме можно использовать фосфатно-буферный солевой раствор, дополненный 5 мм глюкозы (можно использовать для сравнения с сериями анализов, проведенных в плазме), или буферный раствор, более похожий на внутриклеточный раствор, содержащий промежуточные продукты цикла кребса для пермеабилизированных тромбоцитов или лейкоцитов. Внутриклеточный буферный раствор используется для пермеабилизированных тромбоцитов (и лейкоцитов) и при наличии субстратов митохондриального дыхания в избытке (в насыщающих количествах), чтобы максимизировать перенос электронов и увеличить разрешение анализа. Клетки, полученные из образца крови человека, могут быть проанализированы как нативные или пермеабилизированные. В зависимости от того, нативные или пермеабилизированные тромбоциты или лейкоциты, могут быть использованы различные экспериментальные методики (методика suit — титрование субстрат-субстрат-ингибиторной изоляции). Как правило, используются нативные тромбоциты или лейкоциты. Пермеабилизированные тромбоциты или лейкоциты используются для того, чтобы за один эксперимент собрать как можно больше информации об активности различных дыхательных комплексов. Тромбоциты пермеабилизируют путем воздействия на них дигитонином или другими веществами, которые делают цитоплазматическую мембрану клеток проницаемой для субстратов и адф. В качестве других веществ могут выступать сапонин или triton-x. Как видно из примеров, приведенных в данном описании, оптимальная доза дигитонина составляет 1 мкг/лхло6 тромбоцитов. Клетки обычно суспендируются в стеклянной камере прибора в концентрации от 200х106/мл до 400х106/мл. Испытуемый образец может быть добавлен несколько раз в возрастающих концентрациях для определения минимальной концентрации, оказывающей негативное воздействие на митохондрии (т.Е. Вызывающей токсический эффект). Начальная и конечная концентрации испытуемого вещества зависят от его силы, но обычно находятся в диапазоне от субмикромолярных до миллимолярных концентраций. Таким образом, данный метод может быть использован для определения того, какие дозы безопасны, а какие нет, и использования каких, соответственно, следует избегать. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более препаратов или кандидатов в препараты друг с другом с целью определения того, какие препараты или кандидаты в препараты безопасны для использования. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства друг с другом, чтобы определить, какие лекарственные средства или кандидаты в лекарственные средства безопасны для использования. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства друг с другом, чтобы определить, какие лекарственные средства или кандидаты в лекарственные средства безопасны для использования таким образом, указанный метод повторяется с другим(и) исследуемым(и) веществом(ами) и полученные результаты сравниваются. То вещество, которое дает наименьшее снижение дыхания по сравнению с нормальным уровнем, является безопасным с точки зрения токсического действия на митохондрии на рис. 7-9 представлен результат такого сравнения. На рис. 7 представлены результаты двух экспериментов с противодиабетическими препаратами, в одном из которых титровался препарат троглитазон, а в другом — росиглитазон. Из рис. 7 видно, что росиглитазон является более безопасным препаратом, чем троглитазон, с точки зрения митохондриальной токсичности. Троглитазон больше не продается из-за его токсического действия. На рис. 8 представлены результаты двух экспериментов с использованием миноциклина и доксициклина, которые показывают, что доксициклин безопаснее миноциклина. На рис. 9 представлены результаты двух экспериментов с использованием церивастатина и симвастатина, которые показывают, что симвастатин более безопасен, чем церивастатин. Действительно, церивастатин уже снят с производства, а симвастатин остается на рынке. Для повышения активности митохондриальной системы переноса электронов в тромбоциты добавляют карбонилцианид п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другое вещество, увеличивающее проницаемость внутренней мембраны митохондрий для протонов. Как видно из примеров, приведенных в настоящем описании, концентрация в диапазоне от примерно 5 до примерно 100 мкм дает подходящий ответ. Если для растворения тромбоцитов в таблетке используется плазма, то оптимальная концентрация составляет примерно 100 мкм с подходящим диапазоном от примерно 50 до примерно 200 мкм, а если используется фосфатный забуференный солевой раствор (pbs), то оптимальная концентрация низкая, в частности примерно б мкм с диапазоном от примерно 2 до примерно 2 0 мкм. В подходящий момент времени после добавления тестируемого вещества (например, от 1 до 10 мин) последовательно добавляют ингибитор комплекса i (ci), например ротенон, и ингибитор комплекса iii (ciii), например антимицин-а, для ингибирования системы переноса электронов (ets) с сохранением остаточного, немитохондриального потребления кислорода, которое вычитается из различных параметров дыхания в дальнейших анализах. Данная процедура позволяет оценить специфику митохондриального дыхания, а также выявить самоокислительные свойства исследуемых соединений. Ротенон добавляют в количестве, соответствующем конечной концентрации в образце около 2 мкм, в диапазоне от 1 до 5 мкм. Если используется другой ингибитор комплекса i, то его конечная концентрация должна быть такой, чтобы получить тот же эффект, что и при использовании ротенона. Антимицин-а добавляется в количестве, соответствующем конечной концентрации в образце около 1 мкг/мл, в диапазоне от около 0,1 до около 10 мкг/мл. Если используется другой ингибитор комплекса iii, то значение конечной концентрации должно быть таким, чтобы обеспечить тот же эффект, что и при использовании антимицина-а. Антимицин-а всегда добавляют после ротенона, чтобы определить активность комплекса ii после ингибирования комплекса i. Детали экспериментов становятся понятными из примеров и формулы изобретения. 2. Тестирование чувствительности пациента к знакомым митохондриальным токсикантам в настоящее время известно и используется множество известных митохондриальных токсикантов. Однако прежде чем начать медикаментозное лечение, врач должен знать, чувствителен ли пациент к этим препаратам. Одним из примеров является широко используемый противоэпилептический препарат вальпроевая кислота, которая может вызывать серьезные повреждения мозга или печени, если назначается не тем пациентам. Способ по существу аналогичен описанному выше в п. 1). Указанный метод включает в себя: i) спирометрию высокого разрешения клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода в диапазоне 400-25 мкм ог и при постоянной температуре 37°c, ii) контакт образца клеток с карбонилцианидом п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другим веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, чтобы максимизировать активность митохондриальной электрон-транспортной системы, присутствующей в тромбоцитах, iii) добавление тестового образца, содержащего указанное вещество в носителе, с постепенно увеличивающейся дозой, по сравнению с добавленным носителем, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления образца, причем снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (v) контакт образца согласно (iv) с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, для того чтобы, для выявления клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, vi) контактирование образца согласно v) с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Как используется в настоящем документе, образец крови человека берется у пациента, который может получать специфическое лечение конкретными препаратами или кандидатами в препараты, а тестовый образец содержит конкретный препарат или кандидат в препараты. Как описано в (1) выше, тестовый образец может быть введен несколько раз в возрастающих концентрациях с целью выявления минимальной концентрации, которая оказывает негативное воздействие на митохондрии (т.Е. Вызывает токсический эффект), оказывает токсическое действие). Начальная и конечная концентрации испытуемого вещества зависят от его силы, но обычно в 10 раз превышают переходные или устойчивые уровни, чтобы учесть накопление препарата в тканях. Таким образом, данный метод может быть использован для определения того, какие уровни доз безопасны, а какие нет, и, следовательно, каких доз следует избегать.<таким образом, метод может включать сравнение двух или более препаратов или кандидатов в препараты друг с другом для определения вещества с наиболее безопасным профилем для данного пациента. Аналогичным образом этот метод повторяют с другими веществами и сравнивают полученные результаты. Вещество, дающее наименьшее снижение дыхания по сравнению с нормальным уровнем, является наиболее безопасным с точки зрения митохондриальной токсичности для данного пациента. Все подробности, касающиеся отдельных частей указанного метода, приведены ранее в настоящем описании, и на них сделана ссылка. 3. Анализ митохондриальной токсичности препарата в клинических исследованиях клиническое исследование может быть любого типа, например, исследование по определению дозы, исследование безопасности человека и т.Д. И настоящий метод основан на простом заборе крови. Можно оценивать как краткосрочные, острые эффекты, так и долгосрочные, хронические эффекты. Ярким примером являются препараты против вич, которые при длительном применении могут вызывать симптомы митохондриальной недостаточности (вызванной истощением митохондриальной днк). В этом случае большое преимущество метода согласно настоящему изобретению заключается в том, что он позволяет определить общую токсичность лекарственного вещества, а также его метаболитов, циркулирующих в плазме крови пациента. Такой метод практически не отличается от описанного выше, однако образец крови человека берется у субъекта, включенного в исследование, и у здоровых людей, выступающих в качестве контрольной группы. Соответственно, субъект получает лекарственное вещество или лекарственный кандидат до того, как у него будет взят образец крови. Мониторинг митохондриального дыхания может осуществляться на протяжении всего курса лечения или клинического исследования путем регулярного взятия образцов крови у исследуемого субъекта. Таким образом, такой метод включает, в частности, следующее: (i) спирометрию высокого разрешения клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода в диапазоне от 400 до 25 мкм ог и при постоянной температуре 37°c, при этом образец крови берется у человека, который участвует в клиническом исследовании или проходит лечение и которому вводится исследуемое вещество во время клинического исследования или в процессе лечения, (ii) контакт образца клеток с карбонилцианидом п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другим веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов с целью максимизации активности митохондриальной системы переноса электронов, присутствующей в тромбоцитах, (iii) сравнение потребления кислорода образца крови, взятого у человека, участвующего в клиническом исследовании или проходящего лечение, с потреблением кислорода образца крови, взятого у человека из контрольной группы, причем снижение потребления кислорода по сравнению с контрольным образцом указывает на негативное влияние на митохондрии, (iv) контакт образца согласно (ii) с ингибитором функции митохондриального комплекса i, (v) контакт образца согласно (iv) с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. В данном контексте клиническим исследованием может быть любое исследование, в том числе представляющее собой доклинические исследования и долгосрочные исследования безопасности. Как следует из вышесказанного, индивидуум может быть также пациентом, страдающим от какого-либо заболевания или расстройства и получающим лечение одним или несколькими препаратами или кандидатами в препараты образцы могут быть взяты у одного индивидуума или представлять собой объединенные образцы, взятые у нескольких индивидуумов. В некоторых случаях плазма собирается у пациентов, получающих препарат в рамках клинических испытаний или проходящих другое лечение. Плазма должна быть отцентрифугирована и может быть заморожена и храниться до проведения анализа. В этом случае плазма будет содержать исходный препарат, а также его метаболиты (которые могут быть столь же или даже более токсичны для митохондрий, чем исходный препарат). Плазму можно разморозить и добавить в нее здоровые тромбоциты или белые кровяные тельца (лкт), чтобы проверить, повлияет ли плазма на работу митохондрий. Такой подход имеет ряд преимуществ, в том числе отсутствие необходимости в срочной транспортировке крови, полученной в ходе клинических испытаний, для проведения анализа. Все подробности, касающиеся отдельных частей описанного выше метода, приведены в настоящем описании, и на них сделана ссылка. 4. Анализ пользы препаратов, разработанных для улучшения митохондриальной функции крупные скрининговые программы исследований, предшествующие клиническим испытаниям, могут проводиться на клетках, полученных из крови здоровых людей или из лейкотромбоцитарного слоя. Этот метод по существу идентичен методу, описанному в п. 3, но образцы крови человека собирают у пациентов до и во время лечения или после изменения дозы, или после изменения пути введения или формы вводимого препарата. Образцы анализируются, и результаты сравниваются. Например, первый образец крови может быть взят до начала курса лечения (или до изменения курса лечения), а второй образец крови может быть взят во время курса лечения или после изменения курса лечения. Эффект лечения также может быть исследован путем тестирования образцов, взятых в любой момент времени в течение курса лечения. Таким образом, такой метод включает: i) спирометрию высокого разрешения клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода в диапазоне 400-25 мкм ог и постоянной температуре 37°с, при этом испытуемое вещество вводят человеку до взятия образца крови; ii) контакт образца клеток с карбонилцианидом п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другим веществом, повышающим проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, для достижения i) максимальной активности митохондриальной электронно-транспортной системы, присутствующей в тромбоцитах, и iii) сравнение потребления кислорода в первом образце крови человека с потреблением кислорода во втором образце крови, при этом снижение потребления кислорода указывает на отрицательное влияние на митохондрии, а увеличение потребления кислорода указывает на положительное влияние на митохондрии, (iv) контакт образца, полученного согласно (ii), с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, (v) контакт образца, полученного согласно (iv), с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Результат сравнивают с контрольным образцом или со стандартом. Этапы i)-v) могут быть повторены для третьего, четвертого, пятого и т.Д. Образцов в зависимости от типов исследуемых изменений. Первый образец может быть контрольным образцом, т.Е, образец крови, взятый до начала лечения. В качестве альтернативы первый и второй образцы представляют собой образцы крови, взятые в разные моменты времени в ходе одного курса лечения. Например, если курс лечения длится неделю, то первый образец может быть взят в первый день (контрольный образец), а второй образец — во второй день (и последующие образцы могут быть взяты в последующие дни). При изменении режима дозирования первый образец крови может быть взят до изменения дозы, а второй — после изменения дозы. На рис. 10 показаны экспериментальные признаки благоприятного и токсического воздействия на митохондриальное дыхание потенциального кандидата в лекарственные препараты по сравнению с контролем. Все детали, касающиеся отдельных частей указанного метода, приведены и снабжены ссылками в настоящем описании. Функция митохондрий дисфункция митохондрий выявлена при первичных заболеваниях дыхательной цепи, вызванных ядерными мутациями или мутациями митохондриальной днк, а также непосредственно связана с такими заболеваниями, как болезнь хантингтона, болезнь альцгеймера и болезнь паркинсона, а также является результатом чрезмерного воспаления, например воспаления при сепсисе (brealev et al. 2002; ferreira et al. 2010; kones, 2010; rosenstock et al, 2010) . Изучение функции митохондрий необходимо как для фундаментальных исследований физиологии митохондрий и патогенетических механизмов, так и для диагностики митохондриальных заболеваний. Традиционным методом исследования функции митохондрий является определение максимальной ферментативной активности отдельных комплексов системы переноса электронов (спэ) в деградировавших митохондриях методом спектрофотометрии. Преимуществом данного метода является простота хранения и доставки образцов на оборудование ведущих лабораторий, а также высокая производительность анализа, поскольку образцы могут быть заморожены (haas et al. 2 008). Однако митохондрия и ее компоненты не функционируют как отдельные единицы. Комплексы дыхательной цепи связаны между собой в итс, которые, в свою очередь, собираются в мультиферментные комплексы и суперкомплексы (lenaz and genova, 2009). Митохондрии подвергаются слиянию и делению, образуют сети и испытывают взаимное влияние с другими внутриклеточными компартментами (picard et al. 2011). Все вышесказанное ясно указывает на необходимость анализа функционирования митохондрий без разрушения клетки или, по крайней мере, с минимальным ее нарушением и в условиях, максимально приближенных к физиологическим. Этого можно достичь путем полярографического измерения митохондриального дыхания в клетках (kitchens and newcomb, 1968). Дыхание может быть проанализировано в нативных клетках в естественной среде, например в плазме крови, с использованием эндогенных субстратов. Кроме того, благодаря пермеабилизации клеточной мембраны можно открыть прямой доступ к митохондриям для экзогенных субстратов и ингибиторов и исследовать отдельные комплексы ets без необходимости разрушения клеток и выделения митохондрий (hutter et al. 2006). При выборе ткани для исследования митохондриальной дисфункции лучшим выбором является ткань, наиболее сильно пораженная патологическим процессом у данного пациента. Однако это редко возможно из-за инвазивности и рисков, связанных с биопсией из внутренних органов, таких как мозг, печень и сердце. Поэтому используются другие ткани, чаще всего мышечные клетки и фибробласты кожи (haas et al. 2008). Тромбоциты являются легкодоступным источником жизнеспособных митохондрий, а забор образцов менее инвазивен по сравнению с биопсией мышц или кожи. Изменения митохондрий тромбоцитов были продемонстрированы при различных заболеваниях, в первую очередь затрагивающих другие системы органов (hauptmann et al. 2006; krige et al. 1992), а также в процессе старения (merlo pich et al. 1998; xu et al. 2007), поэтому они были предложены в качестве потенциального маркера системной митохондриальной дисфункции (sjovall et al. 2010; xu et al. 2007). Кроме того, тромбоциты хорошо подходят для полярографического анализа (kitchens and newcomb, 1968;. Sjovall et al. 2010). Цель исследования цель исследования, представленного в экспериментальной части, — разработать методику и провести углубленную оценку нормальной дыхательной функции тромбоцитов в условиях ex vivo в нативных жизнеспособных клетках и оценить функцию отдельных комплексов в пермеабилизированных клетках с помощью спирометрии высокого разрешения. Во-вторых, изучены эффекты хранения при низкой и комнатной температуре, влияние пола и возраста и, в-третьих, исследована валидность метода при использовании в различных контрольных группах. Детали, связанные с эталонными экспериментальными установками, приведены в экспериментальной части. Представлены данные, отражающие нормальную дыхательную функцию митохондрий тромбоцитов для различных контрольных групп. На долю окислительного фосфорилирования приходится около 85% общего производства энергии в тромбоцитах в состоянии покоя (kilkson et al. 1984), кроме того, в доставку субстрата вносят вклад гликолиз, [3-окисление жирных кислот (cesar et al. 1987). Запасная дыхательная активность нативных тромбоцитов, т.Е. То, насколько может быть увеличено дыхание под действием разобщающего агента fccp, по сравнению с нормальным состоянием, выше у тромбоцитов, суспендированных в плазме, по сравнению с pbs, о чем свидетельствуют различия в итс/регуляторной процедуре (табл. 2). Вероятно, это отражает различные типы и уровни доставки субстрата в разных средах. Резервная дыхательная активность нативных тромбоцитов составляет около 64% при проведении экспериментов в pbs с использованием только глюкозы в качестве экзогенного субстрата по сравнению с примерно 8 8% при инкубации и анализе клеток в их собственной плазме, где имеется физиологический запас субстрата. При воздействии олигомицина запасная дыхательная активность обычно ниже и составляет примерно 28% в pbs-глюкозе и 2 5% в плазме крови, что, возможно, отражает нарушение энергозависимых путей окисления глюкозы и других субстратов в клетках с подавленной продукцией атф. В пермеабилизированных клетках гликолиз и 3-окисление исключаются из цепи путем доставки насыщающего количества субстратов в цикл лимонной кислоты. В результате этс и протонная цепь могут быть оценены без лимитирующих скорость субстратов. Максимальное потребление кислорода, как конъюгированное с адф, так и стимулированное fccp (без конъюгации), может быть дополнительно увеличено примерно на 50% в пермеабилизированных клетках по сравнению с нативными. Это указывает на лимитирующую стадию доставки субстрата в стимулированные нативные клетки, которая отсутствует в состоянии покоя, поскольку нормальное дыхание одинаково независимо от среды, используемой для суспендирования. Нативные тромбоциты используют nadh и доставку электронов почти исключительно через комплекс i, поскольку после ингибирования комплекса i ротеноном индуцированное комплексом ii дыхание не обнаруживается. Тот факт, что величина ets-дыхания нативных клеток находится в том же диапазоне, что и oxphosci пермеабилизированных клеток, еще раз подтверждает эту точку зрения. Сказанное выше также подчеркивает важность снабжения ets электронами как от комплекса i, так и от комплекса ii в q-связи для установления максимального переноса электронов в пермеабилизированных клетках. При неограниченной доставке субстрата вклад комплекса i составляет примерно 2/3, а комплекса ii — 1/3 от общего дыхания при конвергентной доставке электронов. Было установлено, что атф-синтаза не вызывает существенного ограничения скорости, поскольку максимальная дыхательная активность, стимулированная adp- и fccp, одинакова, а соотношение oxphosci+ii/etsci+ii близко к единице. Кроме того, дыхание тромбоцитов отражает тесную связь с окислительным фосфорилированием, о чем свидетельствует низкий уровень leak-дыхания по сравнению с максимальной дыхательной активностью и соответствующее высокое соотношение ets/leak как в нативных, так и в пермеабилизированных клетках. Авторы настоящего изобретения наблюдали более высокое состояние leak в пермеабилизированных клетках по сравнению с нативными клетками. Хотя пермеабилизация цитоплазматической мембраны дигитонином может влиять на проницаемость митохондриальной мембраны, это не подтверждается наблюдениями авторов настоящего изобретения, поскольку отмечается большой запас достоверности концентрации дигитонина в экспериментах по титрованию дигитонина. Также не было обнаружено влияния экзогенного цитохрома c на дыхание и, следовательно, внешняя мембрана митохондрий оставалась интактной. Более вероятное объяснение заключается в том, что увеличение протонного градиента через внутреннюю мембрану при насыщении доставки субстрата может вызвать увеличение дыхания leak, поскольку это базовое значение дыхания пропорционально силе, приводимой в движение протонами (nicholls, 1977). Снижение функции митохондрий обычно связывают с возрастом (lesnefsky and hoppel, 2008; vendelbo and nair, 2011). В тромбоцитах авторы настоящего изобретения наблюдали снижение дыхания комплекса ii с возрастом без влияния на общую дыхательную функцию, и этот эффект в основном объясняется разницей между детьми и взрослыми участниками исследования. Снижение дыхания, по-видимому, специфично для комплекса ii, так как более значительный снижающий эффект на комплекс iii, комплекс iv или атф-синтазу должен был также влиять на максимальную активность oxphos или ets. Разница между нормальным дыханием и leak-дыханием в целом связана с производством атф в состоянии покоя. Поскольку состояние leak оставалось на одном уровне для всех исследованных возрастов, наблюдаемое здесь увеличение нормального дыхания предполагает увеличение базового производства атф с возрастом. В целом с возрастом происходит снижение скорости метаболизма в состоянии покоя (johannsen and ravussin, 2010), но как это влияет на различные ткани, пока не выяснено. Почему тромбоциты требуют увеличения базовой продукции атф с возрастом, из данного исследования не выяснено. По сравнению со своими взрослыми шведскими сверстниками японские добровольцы демонстрируют примерно на 27% большее leak-дыхание. Это приводит к значительному увеличению etscn/leak в субстрат-стимулированном дыхании комплекса ii, но значительно снижает oxphosci/leak и oxphosci+n/leak. Сообщалось, что у японцев и европеоидов имеются различия в клинической картине заболевания (benfante, 1992). Это объясняется генетическими различиями, а также различиями в факторах питания и образа жизни, поскольку указанные различия в значительной степени исчезают в мигрирующей популяции (yamori, 2 006). Японская кухня традиционно богата рыбой и другими морепродуктами, которые содержат большое количество свободных жирных кислот, обладающих расщепляющими свойствами (cha et al. 2001; davis et al. 2008). Было высказано предположение, что мягкое расщепление полезно с точки зрения старения из-за снижения силы протондрирования и, как следствие, уменьшения продукции ros (brand, 2000). В митохондриальной днк японцев преобладает гаплогруппа d, по сравнению с европейцами, у которых преобладает гаплогруппа h. Учитывая небольшой объем выборки, различия, наблюдаемые в исследовании, проведенном авторами настоящего изобретения, могут быть связаны с генетикой, образом жизни или сочетанием того и другого. Для выяснения этих вопросов необходимы дальнейшие исследования. Уровень дыхания образцов пуповины, как правило, был выше по сравнению с другими группами. Вероятно, это отражает различия в потребностях внутриутробной и внеутробной жизни. Однако данные о функционировании митохондрий в фетальном периоде немногочисленны (yanicostas et al. 2011). Представленный метод потенциально может служить дополнением к существующей стандартной методике оценки предполагаемых митохондриальных заболеваний, которая обычно включает биопсию мышц. В связи с этим авторы настоящего изобретения в настоящее время собирают данные в нескольких различных группах, таких как пациенты с нейродегенеративными заболеваниями и новорожденные дети с подозрением на митохондриальные нарушения. Авторы настоящего изобретения хотели бы оценить ограничения, связанные с хранением, и ограничения, связанные с малым объемом образца. Хотя хранение в пробирках с эдта не является оптимальной средой для тромбоцитов, после 24-часового хранения крови наблюдаются лишь незначительные изменения дыхательной функции. Таким образом, для диагностических целей образец может быть доставлен на большие расстояния в дорогостоящие центры совместного использования оборудования с постоянно поддерживаемыми возможностями для анализа дыхательной активности жизнеспособных тромбоцитов. Для очень маленьких детей могут существовать ограничения, связанные с тем, какой объем крови может быть взят для проведения различных анализов, поэтому авторы настоящего изобретения оценили, насколько низкие концентрации тромбоцитов могут быть использованы и при этом получить<@@> надежные результаты. При концентрации 50х106 тромбоцитов/мл абсолютное потребление кислорода составляет всего около 25 нмоль/мл за весь эксперимент. Состояние дыхания не изменяется при оценке в различных концентрациях, заисключением etsci+n, которое несколько снижается при 50х106 тромбоцитов/мл. Причина этого не вполне понятна, но максимальный эффект fccp и его влияние на неспецифическое связывание с другими клеточными мембранами могут быть изменены при более низком содержании клеток, даже если титрование проводится тщательно. Сила этого метода заключается в возможности сочетать анализ как нативных, так и пермеабилизированных тромбоцитов. Анализ нативных клеток, взвешенных в собственной плазме, включает экспериментальные инфузии, которые, вероятно, очень похожи на физиологические условия. Это позволяет изучать не только врожденные генетические дефекты, но и митохондриальные дефекты, вызванные экзогенными факторами, такими как токсины или лекарственные препараты. Дополнительная информация может быть получена из пермеабилизированных клеток, где с помощью различных методов титрования (suit) можно регулировать поток к различным частям дыхательной системы, чтобы выяснить, где находится патология. Хотя спирометрия может рассматриваться как один из предпочтительных способов оценки биоэнергетической функции митохондрий (brand and nicholls, 2011), а митохондрии тромбоцитов, вероятно, являются хорошим источником жизнеспособных митохондрий человека, этот метод имеет свои недостатки. Заболевания, поражающие митохондрии, могут быть более или менее тканеспецифичными, а мутации в мтднк, как известно, проявляются в разных тканях в разных соотношениях, что известно как гетероплазмия. Таким образом, изменения могут остаться нераспознанными, если они не присутствуют в значительном количестве в анализируемой ткани. Клетки обладают способностью компенсировать снижение уровня атф и обычно имеют порог, при котором компенсация уже невозможна и происходит отказ органа (rossignol et al. 2003). Таким образом, трудно предсказать, на каком уровне снижение митохондриального дыхания следует считать патологическим. Тем не менее, все вышеперечисленные недостатки не являются уникальными для данного метода, а существуют независимо от того, какая ткань или методика используется. В методике титрования настоящего изобретения авторы не включают специфические измерения комплекса iv, который обычно образуется с использованием искусственного донора электронов tmpd в сочетании с аскорбиновой кислотой для поддержания tmpd в восстановленной форме. Тмпд/аскорбат подвергается автоокислению , катализируемому различными металлсодержащими белками (например, цитохромом с), а также зависит от концентрации кислорода. В связи с тем, что авторы настоящего изобретения использовали метод пробоподготовки, количество неспецифического клеточного вещества и плазмы является переменным, и поэтому невозможно сделать какие-либо фоновые поправки на автоокисление тмпд/аскорбата. Заключение измерения дыхания тромбоцитов хорошо подходят для изучения митохондрий человека в физиологических условиях ex vivo. Показано, что надежные результаты могут быть получены для небольших объемов образцов и после хранения до 24 ч с помощью спирометрии высокого разрешения. Применяя различные методики suit, можно получить подробную информацию о клеточной дыхательной активности и различиях между разными экспериментальными группами, и авторы настоящего изобретения описывают, как оценить эти результаты. Данный подход может быть пригоден для оценки как экзогенных, так и эндогенных митохондриальных нарушений, и в настоящее время авторы настоящего изобретения проводят оценку способа согласно настоящему изобретению для решения указанных проблем. Рисунки к рисункам рис. 1. Типичная кривая титрования дигитонина. Тромбоциты с концентрацией 10 0 0*106/мл суспендируют в буфере mir05, изначально содержащем 5 мм сукцината и 1 мм адф. После стабилизации в нормальных условиях дыхание комплекса i ингибируется ротеноном с последующим ступенчатым (20 мкг) титрованием дигитонином до тех пор, пока не будет обнаружено дальнейшее увеличение рис. 2. Процедура эксперимента для нативных тромбоцитов. Эндогенное (нормальное) дыхание сопровождается индукцией комплекса v (leak)-независимого дыхания с помощью олигомицина (1 мкг/мл). Максимальное дыхание достигается титрованием протонофора — карбонилцианида п- (трифторметокси)фенилгидразона (fccp со средней концентрацией б мкм в pbs или 100 мкм в плазме), затем титрованием ротенона (2 мкм) и антимицина- a (1 мкг/мл), ингибирующих комплекс i и комплекс iii соответственно, для измерения остаточного потребления кислорода. Индуцированные состояния дыхания и используемые дыхательные субстраты указаны над графиком. Ets = electron transfer system. Рис. 3. Процедура эксперимента для пермеабилизированных тромбоцитов. Экспериментальная кривая, отражающая скорость потребления кислорода, получена с использованием метода титрования субстрат-дисассоциаторного ингибитора. Над графиком указаны индуцированные состояния дыхания и активированные дыхательные комплексы. Тромбоциты пермеабилизировали дигитонином и одновременно добавляли субстрат комплекса i (ci) малат и пируват (5 мм, соответственно). Затем окислительное фосфорилирование (oxphos) стимулируется добавлением adp (1 мм) с последующим добавлением субстрата комплекса i — глутамата (5 мм). Добавление сукцината (10 мм), связанного с комплексом ii (si), обеспечивает конвергентный вход электронов как через комплекс i, так и через комплекс ii. Oxphos ингибировалась олигомицином (1 мкг/мл), что свидетельствует о независимости дыхания от комплекса v (leak). Максимальная дыхательная активность системы переноса электронов (ets) индуцируется титрованием протонофора, карбонилцианида п- (трифторметокси)фенилгидразона, (fccp, средняя концентрация b мкм) ). Ингибирование комплекса i ротеноном (2 мкм) показывает, что дыхание поддерживается комплексом ii. Остаточное, отличное от митохондриального, потребление кислорода обнаруживается при добавлении ингибитора комплекса iii антимицина-а (1 мкг/мл). Добавление тмпд (0,5 мм) и азида (10 мм) не показано. Индуцированные состояния дыхания и используемые дыхательные субстраты указаны над графиком. Рис. 4. Корреляция возраста и пола с митохондриальным дыханием тромбоцитов. A, корреляция между нормальным дыханием и возрастом, отдельные точки — среднее из двух повторных значений. B. Корреляция между дыханием etscii и возрастом и c. Корреляция между дыханием oxphosci+ii и возрастом. D. Сравнение дыхания etsci+ii между полами. Определение дыхательных состояний см. На рис. 3. Рис. 5. Влияние концентрации тромбоцитов на различные состояния дыхания в пермеабилизированных тромбоцитах. Потребление кислорода при различных состояниях субстрата, метод титрования в диапазоне концентраций от 50 до 400*106 тромбоцитов/мл. Определение дыхательных состояний см. Рисунок 3. N=5, каждый эксперимент проводится дважды, *=p <0,05. Рисунок б. Влияние хранения на различные дыхательные состояния пермеабилизированных тромбоцитов. Кровь хранилась в пробирках с к2эдта под вакуумом на наклонной доске при комнатной температуре или при 4°с. Через 72 ч все параметры, кроме дыхания leak, значительно снижаются по сравнению с временем 0. Состояние дыхания см. Рис. 3. N=4, каждый эксперимент выполнен дважды, *=p <0,05. Рисунок 7. Экспериментальная кривая для определения митохондриальной токсичности троглитазона и росиглитазона. Тромбоциты человека брали в количестве 200*106 клеток/мл в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, hepes 2 0 мм, таурин 2 0 мм, k-лактобионат 60 мм, mds12 3 мм, kh2p04 10 мм, egta 0,5 мм, бычий сывороточный альбумин 1 г/л, ph 7,1. Троглитазон проявляет митохондриальную токсичность, о чем свидетельствует снижение потока кислорода при увеличении концентрации. Fccp (2 мкм), ротенон (2 мкм) и антимицин (1 мкг/мл) указаны там, где они добавлены. Hssr=карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразона. На рис. 8 представлена экспериментальная кривая для определения митохондриальной токсичности миноциклина и доксициклина. Тромбоциты человека были взяты в количестве 200*106 клеток/мл в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, hepes 2 0 мм, таурин 2 0 мм, к-лактобионат 60 мм, мдс1г 3 мм, kh2po4 10 мм, egta 0,5 мм, бычий сывороточный альбумин 1 г/л, ph 7,1. Миноциклин проявляет митохондриальную токсичность, о чем свидетельствует снижение потока кислорода при увеличении концентрации. Доксициклин также проявляет токсичность, но менее выраженную, чем миноциклин. Fccp (2 мкм), ротенон (2 мкм) и антимицин (1 мкг/мл) указаны при добавлении. Hccp=карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразона. На рис. 9 представлена экспериментальная кривая для определения митохондриальной токсичности церивастатина и симвастатина. Тромбоциты человека брали в количестве 200*106 клеток/мл в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, hepes 2 0 мм, таурин 2 0 мм, к-лактобионат 60 мм, мдс1г 3 мм, kh2po4 10 мм, egta 0,5 мм, бычий сывороточный альбумин 1 г/л, рн 7,1. Церивастатин проявляет митохондриальную токсичность, о чем свидетельствует снижение потока кислорода при увеличении концентрации. Fccp (2 мкм), ротенон (2 мкм) и антимицин (1 мкг/мл) указаны в местах их добавления. Gssr=карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразон. На рис. 10 представлены экспериментальные кривые полезного и токсического действия нового лекарственного препарата на митохондриальное дыхание по сравнению с контролем. Тромбоциты человека брали в количестве 200*106 клеток/мл в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, 20 мм hepes, 2 0 мм таурина, 60 мм к-лактобионата, 3 мм мдс1г, 10 мм кн2ро4, 0,5 мм egta, 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, рн 7,1. Fccp (2 мкм), ротенон (2 мкм) и антимицин (1 мкг/мл) указаны там, где они добавлены. Доза, добавляемая на каждом шаге титрования, указана над графиком. Предлагаемый препарат усиливает дыхание митохондрий до накопленной дозы 2 мм, после чего дыхание снижается при дальнейшем титровании, что свидетельствует о токсичности митохондрий. Gssr=карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразон. На рис. 11 представлена схема скринингового анализа митохондриального комплекса ii. Схема описывает методику оценки новых клеточно-пермеабилизирующих митохондриальных субстратов. В этом анализе функция митохондрий в нативных клетках подавляется ингибитором дыхательного комплекса i — ротеноном. Препараты-кандидаты сравниваются с эндогенными субстратами до и после пермеабилизации цитоплазматической мембраны для оценки усиления или подавления биоэнергетики. На рис. 12 представлена схема скринингового анализа конвергентного дыхания митохондрий. Схема описывает методику оценки эффективности новых клеточно-пермеабилизирующих митохондриальных субстратов. В этом анализе митохондриальная активность стимулируется путем расцепления митохондрий с помощью протонофора fccp. Препараты-кандидаты титруются для получения максимального уровня конвергентного дыхания (индуцируемого комплексом i и комплексом ii). После добавления ротенона достигается стимуляция, зависящая от комплекса ii. Для оценки величины немитохондриального потребления кислорода добавляют ингибитор комплекса iii антимицин. На рис. 13 показано увеличение дыхания (потока кислорода на единицу) при ступенчатом титровании препарата по сравнению с контролем (динатрия сукцинат) в нативных тромбоцитах человека (анализ описан на рис. 12). На рис. 14 показана зависимость потребления кислорода от митохондриальных комплексов i, ii и iv, соответственно. Потребление кислорода измеряется при различных концентрациях метформина в буфере по методике, описанной выше. При увеличении концентрации метформина наблюдается значительное снижение дыхания в комплексе i. Данные выражены как среднее значение и стандартное отклонение. *P < 0,05, ***: p < 0,001 по сравнению с носителем (0 мм метформина). Тромбоциты человека брали в количестве 200*106 клеток/мл в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, hepes 2 0 мм, таурин 2 0 мм, к-лактобионат 60 мм, мдс1г 3 мм, kh2po4 10 мм, egta 0,5 мм, бычий сывороточный альбумин 1 г/л, рн 7,1. Экспериментальная часть материалы и методы 1.1 отбор образцов у людей. Исследование было одобрено региональным советом по этике, лунд, швеция (взрослые: 113/2008 и 644/2009, дети: 59/2009), а также комитетом по этике токийского медицинского университета, япония (разрешение № 1514). Для взрослых шведских пациентов образцы крови были получены от здоровых доноров крови на центральном донорском пункте больницы университета сконе в лунде, а также от здоровых взрослых, проходящих реабилитацию после травмы колена. Японская группа состояла из здоровых взрослых добровольцев. Забор образцов осуществлялся после получения письменного информированного согласия. Эксперименты проводились в соответствии с одинаковыми процедурами и методиками и одними и теми же исследователями в обоих исследовательских центрах. Педиатрические контрольные образцы были получены от пациентов, которым проводились небольшие плановые хирургические вмешательства. Письменное информированное согласие получали от родителей или опекунов, забор крови осуществлялся до введения в наркоз. Пуповинная кровь собиралась после родов у здоровых родильниц с нормально протекавшей беременностью. Забор образцов осуществлялся после получения письменного информированного согласия. Все химические реактивы приобретались у компании sigma-aldrich (сент-луис, миссури, сша), если не указано иное. 1.2 тромбоцитика 1.2 тромбоцитика у доноров крови образцы брали из пробирок для забора одновременно с обычной донацией, а в других группах взрослых и детей — путем венепункции. Пуповинная кровь отбиралась сразу после рождения вагинально или путем кесарева сечения. Кровь взрослых объемом 21 мл, детей — 6-12 мл, пуповины — 3-6 мл забирали в пробирки с к2эдта (vacuette(r), greiner bio-one gmbh, kremmünster, австрия). В предварительных экспериментальных исследованиях было показано, что к2эдта обеспечивает лучший выход и ингибирует активацию тромбоцитов по сравнению с гепарином, цитратом и цитратом декстрозы кислой (акд) в качестве антикоагулянтов (данные не показаны). Для анализа использовали свежеприготовленные образцы крови , которые анализировали в течение 3-5 ч. Пробирки центрифугировали в течение 15 мин при zooxd при комнатной температуре и получали богатую тромбоцитами плазму (prp). Указанную prp отбирали пипеткой и центрифугировали в течение 5 мин при 4600xd при комнатной температуре, получая практически бесклеточную плазму и тромбоцитарный планшет. Таблетку растворяли в 1-3 мл собственной плазмы, полученной от испытуемого, путем осторожного добавления с помощью пипетки и получали высокообогащенную prp со средней конечной концентрацией 1864х106/мл (диапазон 941-2498) 1.3 спирометрия высокого разрешения дыхание измеряли при постоянной температуре 37°с на оксигемографе высокого разрешения (0xygraph-2k oroboros instruments, innsbruck, austria (gnaiger et al. , 2000)) в стеклянных камерах объемом 2 мл при скорости вращения мешалки 7 50 об/мин. Данные регистрировали с помощью программы datlab 4.3. (Oroboros instruments, innsbruck, austria), частота дискретизации составляла 2 с. Все эксперименты проводились при концентрации кислорода в диапазоне 210-50 мкм ог. При необходимости реоксигенацию проводили путем кратковременного частичного открытия пробки камеры на короткое время для уравновешивания воздуха. Фоновый поток кислорода в приборе измерялся в отдельной серии экспериментов и автоматически корректировался в последующих экспериментах в соответствии с инструкцией производителя. Для измерения дыхания в пермеабилизированных клетках тромбоциты суспендировали в среде для митохондриального дыхания (mir05), содержащей 110 мм сахарозы, 2 0 мм hepes, 2 0 мм таурина, 60 мм к-лактобионата, 3 мм мдс1г, 10 мм kh2po4, 0,5 мм egta, 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, рн 7,1 (gnaiger et al. 2000). Для экспериментов в нативных клетках тромбоциты суспендировали либо в фосфатно-буферном солевом растворе (pbs) с добавлением 5 мм глюкозы, либо в собственной плазме контрольного испытуемого. Калибровка при насыщении воздуха проводилась каждый день перед началом экспериментов путем смешивания воды или дыхательной среды millipore с воздухом в камере оксигемографа до достижения равновесия или получения стабильного сигнала. Концентрация кислорода рассчитывалась автоматически по барометрическому давлению и коэффициентам растворимости, которые были равны 1,0 для воды, 0,92 для mir05 и глюкозы в pbs и 0,89 для плазмы (baumqartl and lubbers, 1983). 1.3.1 экспериментальные методы для наивных тромбоцитов интегральное дыхание нативных клеток с эндогенным митохондриальным субстратом оценивалось с помощью двух различных методов титрования. Тромбоциты суспендировали либо в pbs-глюкозе, либо в собственной плазме контрольного испытуемого. Первоначально образцы оставляли для стабилизации на уровне нормального состояния дыхания, определяя потребность клеток в энергии для окислительного фосфорилирования (oxphos). Для оценки вклада дыхания, не зависящего от фосфорилирования адф, последовательно добавляли олигомицин (1 мкг/мл, ингибитор атф-синтазы), вызывая состояние дыхания leak (также известное как состояние дыхания 4, вызванное олигомицином). Максимальная активность ets измерялась после тщательного титрования протонофором, карбонилцианидом п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp), до тех пор, пока не было зарегистрировано дальнейшее увеличение дыхания (в pbs средняя концентрация b мкм, в плазме средняя концентрация 100 мкм). Затем последовательно добавляли ротенон (2 мкм, ингибитор комплекса i [ci]) и антимицин-а (1 мкг/мл, ингибитор комплекса iii [ciii]) для ингибирования ets, получая остаточное потребление кислорода, которое вычитали из различных параметров дыхания в дальнейших анализах. Для оценки влияния ингибирования атф-синтазы на максимальную дыхательную активность использовалась вторая экспериментальная процедура, в которой активность ets оценивалась прямым титрованием fccp после стабилизации нормального дыхания с последующим введением тех же ингибиторов, что и выше. Коэффициент контроля получали из максимального, стимулированного fccp, дыхания, деленного на дыхание leak (ets/leak) и нормальное дыхание (ets/normal respiration). 1.3.2 методология эксперимента для пермеабилизированных тромбоцитов для получения ets с насыщающими экзогенными субстратами и ингибиторами цитоплазматическую мембрану пермеабилизировали детергентом дигитонином. Для определения оптимальной концентрации дигитонина, вызывающей максимальную пермеабилизацию цитоплазматической мембраны и не затрагивающей внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий, была проведена серия экспериментов. Тромбоциты (200*106/мл) суспендировали в mir05 и предварительно инкубировали с 1 мм адф, 5 мм сукцината и 1 мкм ротенона. Дигитонин 10 мкг/мл титровали до получения максимального респираторного ответа (gnaiger et al. 1998). Пример кривой титрования, полученной в ходе эксперимента, приведен на рис. 1. Было установлено, что оптимальная доза составляет 1 мкг/1х106 тромбоцитов. Экзогенный цитохром c не оказывалзначимого влияния на дыхание, что свидетельствует о сохранности внешней мембраны митохондрий (данные не показаны). Для установления активности дыхания с потоком электронов через комплекс i и комплекс ii (ci) по отдельности, а также конвергентного поступления электронов через q-связь (ci + ii) использовали метод титрования субстрат-сепарирующего агента (suit) (gnaiger, 2009). После установления нормального дыхания начинали титрование с пермеабилизации цитоплазматической мембраны дигитонином и одновременного добавления малата (5 мм) и пирувата (5 мм). Активность комплекса oxphos i, активируемого через субстраты, связанные с nadh, оценивали путем добавления adp (1 мм) и дополнительного количества глутамата (5 мм) (oxphosci, или состояние 3ci). Затем добавляли 10 мм сукцината, что вызывало максимальную активность oxphos с конвергентным входом как через комплекс i, так и через комплекс ii (oxphosci+n, или состояние 3ci+n). Олигомицин (1 мкг/мл) ингибировал атф-синтазу и вызывал leak-дыхание. Максимальную активность конвергентного дыхания ets получали титрованием с помощью fccp (etsci+n, средняя концентрация b мкм). Комплекс i ингибировали ротеноном (2 мкм) для определения активности ets, поддерживаемой сукцинатом только комплексом ii (etscn). Наконец, поток электронов через ets ингибировали добавлением антимицина-а (1 мкг/мл), выявляя остаточное потребление кислорода, не связанное с ets. Контрольные соотношения получали из максимального окислительного дыхания или максимального fccp-стимулированного дыхания, деленного на leak-дыхание (oxphosci+n/leak и etsci+n/leak, соответственно). Исследуемые образцы хранились при температуре -8 0°с. 1.4 анализ данных статистическую оценку проводили с помощью программы graph pad prism (graphpad software, версия 5.01, la jolla, ca, usa) . Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего или индивидуальные значения. Былопоказано, что все значения из разных групп, за исключением пуповины и контрольных отношений нативных клеток (ets/leak, ets/нормальное дыхание), имели нормальное распределение согласно обобщенному тесту нормальности д’агостино и пирсона. Сравнение между группами проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа с вторичным анализом между группами с использованием критерия множественного сравнения тьюки для параметрических данных и теста краскала-уоллиса с критерием множественного сравнения данна для непараметрических данных. Для корреляции с возрастом использовалась линейная регрессия. Статистически значимым считалось значение p < 0,05. 2. Результаты образцы крови были получены от 4 6 здоровых взрослых добровольцев (24 из швеции и 22 из японии), 2 8 мужчин и 18 женщин, средний возраст которых составил 37 лет (диапазон 19-65 лет), от 25 детей, 18 мальчиков и 7 девочек, средний возраст которых составил 4 года (диапазон от 1 месяца до 12 лет), а также 22 образца пуповинной крови (13 после кесарева сечения и 9 после вагинальных родов). 2.1 выживаемость, жизнеспособность и целебность тромбоцитов mytochondria концентрацию тромбоцитов измеряли в цельной крови, и выход, рассчитанный после приготовления высокообогащенной тромбоцитами плазмы, составил в среднем 92% (±8%, n=1b). Для оценки жизнеспособности тромбоцитов после завершения методики приготовления была проведена спирометрия тромбоцитов, отцентрифугированных в одну стадию, а именно zoohd в течение 15 мин, и сравнение с дыханием после получения таблетки. Существенных различий выявить не удалось, что свидетельствует о хорошей стабильности и жизнеспособности тромбоцитов на протяжении всего процесса выделения (n=16, данные не показаны). 2.2 митохондрическое дыхание нативных тромбоцитов пример экспериментальной кривой для нативных клеток представлен на рис. 2, а значения параметров дыхания — в табл. 1. В нативных клетках дыхание стимулируется только эндогенными субстратами. Нормальное дыхание одинаково в клетках, инкубированных как в pbs-глюкозе, так и в плазме крови. Дыхание leak было очень низким, менее 1 пмоль og/сек/u8 тромбоцитов. Таким образом, высокое соотношение ets/leak в контроле свидетельствует об очень тесно связанном дыхании. Максимальная стимуляция ets под действием fccp была значительно выше в экспериментах с олигомицином, а свободная дыхательная активность, о которой свидетельствует контрольное соотношение ets/leak, была значительно выше в тромбоцитах, суспендированных в плазме, по сравнению с тромбоцитами, обработанными pbs-глюкозой. Ингибирование комплекса i ротеноном подавляло дыхание на ~ 99%, а после добавления антимицина-а дальнейшего ингибирования не наблюдалось (табл. 1). Существенная разница между различными группами наблюдалась между максимальным fccp-стимулированным дыханием (ets) в японской контрольной группе по сравнению с пуповинной кровью (15+1,3 против 2 3+2,3 пмоль о2/сек/1*106 тромбоцитов). Других значимых различий не наблюдалось. 2.2. 1 митохондрическое дыхание пермеабилизированных тромбоцитов методика suit была разработана для получения максимально возможного количества информации об активности различных дыхательных комплексов в рамках одного эксперимента. Пример кривой с добавлением субстрата и ингибитора и определением различных состояний показан на рис. 3. Нормальное клеточное дыхание в mir05 находилось в том же диапазоне, что и для нативных тромбоцитов, инкубированных в pbs-глюкозе или в плазме. После добавления дигитонина наблюдалось устойчивое снижение дыхания по мере диффузии цитозольного субстрата и аденинового нуклеотида в окружающую среду. В присутствии малата и пирувата, как субстратов i, стимуляция адф увеличивала дыхание на -80%, по сравнению с нормальным дыханием. При добавлении глутамата для дальнейшей генерации nadh и введения электронов комплекса i дыхание увеличивалось еще на -10% (табл. 2). После добавления сукцината конвергентный поток электронов достигался при введении ets как комплекса i, так и комплекса ii, при этом уровень дыхания увеличивался в три раза по сравнению с нормальным дыханием и на -50% по сравнению с использованием только субстрата комплекса i. Дыхание leak составляло -15% от максимального связанного дыхания, oxphosci+n. Отношение oxphosci+n/leak, равное -7,0, свидетельствует о хорошем сопряжении переноса электронов с синтезом атф и сопоставимо с другими тканями (кузнецов и др. 2002) (табл. 2). Максимальная активность дыхания etsci+h, индуцированная протонофором fccp, была на -5% выше по сравнению с oxphosci+n- соотношение oxphos/ets было близко к единице и указывало на то, что при насыщении экзогенными субстратами система фосфорилирования практически не ограничивает поток. Активность etscn, измеренная после ингибирования комплекса i ротеноном, составила -35% от суммарной активности комплекса i и комплекса ii, etsci+n- в японских референсных данных максимальное дыхание с субстратами комплекса i, а также конвергентным входом такое же, как и у шведских участников. Однако и leak-дыхание, и стимулированное комплексом ii дыхание были на -2 5% выше по сравнению с данными шведской и педиатрической групп, что привело к снижению соотношения ets ci+ii/leak (табл. 2). Показатели пуповинной крови отличались, демонстрируя более высокие значения максимального дыхания как для oxphos, так и для ets. Дыхание leak также было значительно выше как в абсолютных, так и в относительных значениях по мере уменьшения конечных коэффициентов (табл. 2). 2.3 корреляция с возрастом и полом два состояния дыхания показали значительную корреляцию с возрастом. Нормальное дыхание увеличивалось (r^=0,15, p<0,05), а etscn несколько уменьшалось (r2=0,14, p<0,05) с возрастом (данные по пуповинной крови не включены), как показано на рис. 4а и 4б. Значительных изменений между всеми остальными параметрами дыхания не наблюдалось, что видно на примере oxphosci+n на рис. 4c. Корреляции между параметрами дыхания и полом не наблюдалось ни для нативных, ни для пермеабилизированных тромбоцитов (рис. 4d). 2 .4 линейность дыхания при разных концентрациях тромбоцитов дыхание оценивали при различных концентрациях тромбоцитов. В диапазоне 100-400х106 тромбоцитов/мл дыхание оставалось линейным во всех условиях. При концентрации 50х106 тромбоцитов/мл максимальная стимуляция fccp снижалась на 20-25% (рис. 5). Большинство дальнейших экспериментов проводилось при концентрации тромбоцитов 200х106/мл. Метод показал хорошую воспроизводимость при оценке результатов экспериментов, проведенных на одних и тех же людях в разные дни. Коэффициент вариации составил 6-13% для различных параметров дыхания (табл. 3). 2.5 влияние длительного хранения крови на параметры дыхания было оценено влияние хранения цельной крови на митохондриальное дыхание. Свежезабранную кровь хранили в ампулах с эдта при комнатной температуре или при 4°с на наклонной доске до 72 ч. Через 2 4 ч дыхание оставалось стабильным. Через 4 8 ч наблюдалась четкая тенденция к снижению дыхательной активности субстратно-стимулированных состояний дыхания, а именно, oxphosci, oxphosci+i и ets ci+ii — через 72 ч все параметры, кроме дыхания leak, значительно снизились (рис. 6) . 3. Методы исследования клеток белой крови 3.1 подготовка образцов у пациентов через имеющийся внутриартериальный катетер забирали не более 4 0 мл крови в пробирки с k2edta (vacuette(r), greiner bio-one gmbh, kremmünster, австрия). В контрольной группе забор крови осуществлялся путем венепункции в пробирки с k2edta. Лейкоциты выделяли из цельной крови методом градиентного центрифугирования в среде ficoll (boyum ref). После отмывки в нормальном физиологическом растворе клетки ресуспендировали, в зависимости от выхода, в 200-400 мкл физиологического раствора вместе с 50-100 мкл собственной плазмы испытуемого. Спирометрические измерения проводили в течение 5 ч после взятия проб. Анализируемое содержимое спирометрической камеры хранилось в замороженном виде до следующего использования. 3.2 высокая спирометрия лейкоциты помещались в камеру оксигемографа объемом 2 мл с конечной концентрацией (2,5-5)*106 клеток/мл. В случае нативных клеток дыхательная среда состояла из собственной плазмы, а в случае пермеабилизированных клеток — из 110 мм сахарозы, 2 0 мм hepes, 2 0 мм таурина, 60 мм к-лактобионата, 3 мм мдс1г, 10 мм kh2po4, 0,5 мм egta, 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, рн 7,1 (мир05) [gnaiger et al. Измерения проводили при постоянной температуре 37°с в оксигемографе высокого разрешения (oxygraph-2k, oroboros instruments, innsbruck, austria). Концентрацию кислорода (мкм) и поток кислорода (отрицательная производная по времени от концентрации кислорода; пмоль о2*сек_1*10~6 клеток) регистрировали с помощью программы datlab 4.3 (oroboros instruments, innsbruck, austria). Все эксперименты проводились при концентрациях кислорода в диапазоне 210-50 мкм ог — калибровка при насыщении воздуха проводилась ежедневно. Фоновый поток кислорода в приборе измерялся в отдельной серии экспериментов и автоматически корректировался в последующих экспериментах в соответствии с инструкцией производителя. Концентрация кислорода рассчитывалась автоматически по барометрическому давлению и коэффициентам растворимости, которые были равны 1,0 для воды, 0,92 для mir05 и 0,89 для плазмы. Использовались три методики субстратно-бессодержательно-ингибиторного титрования (suit) — одна для нативных клеток и две для пермеабилизированных [pesta and gnaiger, 2012]. В нативных клетках стимуляция экзогенным субстратом была ограничена из-за плохой проницаемости через цитоплазматическую мембрану. Поэтому дыхание поддерживалось только эндогенными субстратами. Клетки суспендировали в собственной плазме крови испытуемого и оставляли до стабилизации нормального дыхания. В дыхательную камеру добавляли олигомицин (1 мкг/мл), чтобы вызвать состояние, напоминающее дыхание 4 (leak или состояние 4i), при котором дыхание обеспечивается в основном за счет проникания протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Максимальный поток кислорода достигался поэтапным (20-40) мкм титрованием разобщителя fccp. Наконец, комплекс i и комплекс iii ингибировали добавлением ротенона (2 мкм), а затем антимицина-а (1 мкг/мл). Остаточный поток кислорода вычитался из значений при стационарном митохондриальном дыхании. Вторая и третья методики suit использовались для пермеабилизированных клеток. Первые шаги были одинаковыми для обеих методик. После стабилизации нормального клеточного дыхания цитоплазматическую мембрану клеток пермеабилизировали путем добавления дигитонина (3 мкг/1*106 клеток, оптимальная концентрация оценивалась в другой серии экспериментов; данные не показаны). В дыхательную камеру одновременно добавляли субстраты комплекса i — малат и пируват (5 мм, соответственно). Последующее добавление адф (1 мм) стимулировало дыхание и определяло активность окислительного фосфорилирования (oxphos или состояние 3) для данной комбинации субстратов, связанной с nadh. Пируват превращается в ацетил-коа под действием пируватдегидрогеназы в митохондриальном матриксе, поэтому активность oxphos может быть ограничена, если фермент не функционирует должным образом или ингибирован. Последующее добавление глутамата (5 мм) блокировало пируватдегидрогеназу и максимизировало дыхание nadh-связанного комплекса i, oxphosci. Последующее добавление сукцината (10 мм) стимулировало oxphosci+n с конвергентным поступлением электронов через комплекс i и комплекс ii посредством q-связи. В этот момент протоколы suit расходятся. В suit-2 дыхание, связанное с комплексом i, ингибировалось ротеноном (2 мкм), что сохраняло активность oxphosci+n с поступлением электронов только через комплекс ii. Затем системы переноса электронов (ets) в комплексе iii ингибировали добавлением антимицина-а, а поток остаточного кислорода вычитали из значения стационарного митохондриального дыхания. В suit 3 после достижения максимальной активности oxphosci+n атф-синтазу ингибировали олигомицином (1 мкг/мл) для оценки leakci+n дыхания (состояние 4), которое обусловлено преимущественно проницаемостью протонов или утечкой через внутреннюю митохондриальную мембрану. Максимальный перенос электронов при дыхании без окислительного фосфорилирования, etsci+n, оценивали путем ступенчатого (2-4 мкм) титрования fccp. Зависимое от комплекса i дыхание, не связанное с окислительным фосфорилированием, etscn, оценивали добавлением ротенона, после чего ets ингибировали антимицином-а. В этот момент проводили реоксигенацию по методу suit-2 и suit-3 примерно до 160180 мкм 02. Активность комплекса iv оценивали, добавляя n,n,n,n’,n’-тетраметил-п-фенилендиамин (тмпд 0,5 мм), донор электронов для комплекса iv. В связи с автоокислением тмпд добавляли азид натрия (10 мм), ингибитор комплекса iv, и по разнице между двумя полученными уровнями рассчитывали активность комплекса iv далее перечислены более конкретные методики скрининга, потенциальные кандидаты в препараты. Использовались две методики скрининга. (1) первоначальный скрининг на эффекты комплекса ii проводился с изолированными тромбоцитами или лейкоцитами в буфере, содержащем 110 мм сахарозы, hepes 2 0 мм, таурин 2 0 мм, k-лактобионат 60 мм, mds1g 3 мм, kh2po4 10 мм, egta 0,5 мм, бычий сывороточный альбумин 1 г/л, ph 7,1. После достижения базового уровня дыхания с помощью эндогенных субстратов комплекс i ингибировали 2 мм ротенона. Препараты-кандидаты, растворенные в дмсо, ступенчато титровали до конечной концентрации 100 мкм, 50 0 мкм и 5 мм. Затем клеточные мембраны пермеабилизировали дигитонином (1 мг/1*106 тромбоцитов). После стабилизации дыхания добавляли 10 мм сукцината, а после стабилизации дыхания эксперимент прекращали добавлением антимицина до конечной концентрации 1 мкг/мл и измеряли остаточное дыхание. На рис. 11 представлена методика оценки новых митохондриальных субстратов, проникающих в клетки. В этом анализе функция митохондрий в нативных клетках подавлялась ингибитором дыхательного комплекса i — ротеноном. Препараты-кандидаты сравнивались с эндогенными субстратами до и после пермеабилизации цитоплазматической мембраны для оценки усиления или подавления биоэнергетики. На рис. 11 схематически показан скрининговый анализ митохондриального комплекса ii. На рисунке представлена методика оценки новых проникающих в клетку митохондриальных субстратов. В этом анализе функция митохондрий в нативных клетках подавлялась ингибитором дыхательного комплекса i — ротеноном. Препараты-кандидаты сравнивались с эндогенными субстратами до и после пермеабилизации цитоплазматической мембраны для оценки усиления или подавления биоэнергетики. (2) во второй методике для конвергентного дыхания использовались те же дыхательный буфер и концентрация клеток, что описаны выше. После достижения базового уровня дыхания добавляли митохондриальный разобщитель fccp в концентрации 2 мм. Препараты-кандидаты, растворенные в дмсо, ступенчато титровались до конечной концентрации 100 мкм, 2 00 мкм, 400 мкм, 600 мкм, 1 мм, 2 мм, 5 мм и 10 мм. Отмечалась концентрация, необходимая для достижения максимального конвергентного дыхания. Эксперимент прекращали добавлением 2 мкм ротенона и 1 мкг/мл антимицина и измеряли остаточное дыхание. На рис. 12 представлена методика оценки эффективности новых митохондриальных субстратов, способных пермеабилизировать клетки. В этом анализе митохондриальная активность стимулировалась путем дезассоциации митохондрий с помощью протонофора fccp. Препараты-кандидаты титровались до достижения максимального уровня конвергентного (стимулируемого комплексом i и комплексом ii) дыхания. После добавления ротенона была получена комплекс ii зависимая стимуляция комплексом ii. Для оценки немитохондриального-ассоциированного потребления кислорода добавляли ингибитор комплекса iii антимицин. На рис. 12 схематично изображен метод скрининга конвергентного митохондриального дыхания. На фиг описана методика оценки потенции новых субстратов митохондрий, способных пермеабилизировать клетки. В этом анализе митохондриальная активность стимулировалась путем разборки митохондрий с помощью протонофора fccp. Препараты-кандидаты титровались до достижения максимального уровня конвергентного (стимулируемого комплексом i и комплексом ii) дыхания. Стимуляция, зависящая от комплекса ii, была получена после добавления ротенона. Для оценки потребления кислорода несвязанными митохондриями добавляли ингибитор комплекса iii антимицин. При скрининге конвергентного дыхания идеальное соединение показывает более высокий уровень дыхания при пошаговом титровании по сравнению с контролем в несвязанных митохондриях из нативных клеток. На рис. 12 представлена схема методики, а на рис. 13 — иллюстративные графики, полученные в экспериментах с примерами соединений под номерами 3, 5 и 13 на рис. 13. На рис. 13 показано увеличение дыхания (потока кислорода на единицу) при ступенчатом титровании препаратом по сравнению с контролем (динатрия сукцинат) в нативных тромбоцитах человека (рис. 12) . Свойства примерных соединений (1) идеальное соединение стимулирует дыхание в ингибированных ротеноном нативных клетках при низкой концентрации в методике протокола скрининга si, при этом отсутствует ингибирующий эффект на сукцинат-стимулированное дыхание после пермеабилизации. После ингибирования дыхания митохондриальными токсинами дыхание должно быть прекращено. См. Рис. 1 и список ниже. A> b означает, что a больше b a> > b означает, что a значительно больше b a^-b означает, что значение a приближается к значению b рекомендуемые свойства составителя: максимальное значение достигается при низкой концентрации препарата. A «a’ a^b’ a^b’ c^c’ d-> d’ соединения, не способные проникать через клеточную мембрану, идентифицируются в анализе как: a^a’ немитохондрий-ассоциированное потребление кислорода, индуцированное лекарственным кандидатом, идентифицируется, когда d> d’ references baumgartl, h. Lubbers, d. 1983. Микроаксиальный игольчатый датчик для полярографического измерения локального давления 02 в клеточном диапазоне живой ткани. Его конструкция и свойства, в: gnaiger, e. Forstner, h. (Eds.), Polarographic oxygen sensors. Springer, berlin, heidelberg, new york, pp. 37-65. Benfante, r. 1992. Исследования сердечно-сосудистых заболеваний и тенденций смертности по конкретным причинам у американских мужчин японского происхождения, проживающих на гавайях, и сравнение факторов риска с другими японскими популяциями в тихоокеанском регионе: обзор. Human biology 64, 791-805. Boushel, r. Gnaiger, e. Schjerling, p. Skovbro, m. Kraunsoe, r. Dela, f. 2007. Пациенты с диабетом 2 типа имеют нормальную функцию митохондрий в скелетных мышцах. Diabetologia 50, 790-796. Brand, m.D. 2000. Uncoupling to survive? Роль неэффективности митохондрий встарении. Экспериментальная геронтология 35, 811-820. Brand, m.D. Nicholls, d.G. 2011. Оценка митохондриальной дисфункции в клетках. Biochem. J. 435, 297-312. Brealey, d. Brand, m. Hargreaves, i. Heales, s. Land, j. Smolenski, r. Davies, n.A. Cooper, c.E. Singer, m. 2002. Ассоциация между митохондриальной дисфункцией и тяжестью и исходом септического шока. Lancet 360, 219-223. Cesar, j. Diminno, g. Alam, i. Silver, m. Murphy, s. 1987. Метаболизм свободных жирных кислот в плазме крови во время хранения концентратов тромбоцитов для переливания. Transfusion 27, 434-437. Cha, s.H. Fukushima, a. Sakuma, k. Kagawa, y. 2001. Хроническое потребление докозагексаеновой кислоты усиливает экспрессию гена белка, не связывающегося с клетками, 3 и влияет на уровни плейотропных мрнк в скелетных мышцах пожилых мышей c57bl/6njcl. The journal of nutrition 131, 2636-2642. Cocco, t. Sgobbo, p. Clemente, m. Lopriore, v. Grattagliano, i. Di paola, m. Villani, g. 2005. Тканеспецифические изменения функций митохондрий у пожилых крыс: влияние длительной диетической обработки n-ацетилцистеином. Free radic biol med 38, 796-805. Darnold, j.R. Vorbeck, ml. Martin, a.P. 1990. Влияние старения на путь окислительного фосфорилирования. Mech ageing dev 53,157-167. Davis, l.M. Rho, j.M. Sullivan, p.G. 2008. Ucp-опосредованное расцепление свободных жирных кислот в изолированных митохондриях коры головного мозга голодающих животных: корреляции с диетическими модуляциями. Epilepsia 49 suppl 8, 117-119. Ferreira, i.L. Resende, r. Ferreiro, e. Rego, a.C. Pereira, c.F. 2010. Множественные дефекты энергетического метаболизма при болезни альцгеймера. Curr drug targets 11, 1193-1206. Gnaiger, e. 2009. Мощность окислительного фосфорилирования в скелетных мышцах человека: новые перспективы митохондриальной физиологии. Int j biochem cell biol 41,18371845. Gnaiger, e. Kuznetsov, a.V. Lassnig, b. Fuchs, a. Reck, m. 1998. Высокоразрешающая респирометрия — оптимальная пермеабилизация клеточной мембраны дигитонином, in: larsson, c, plhlman, l.-L, gustafsson, l. (Eds.), Biothermokinetics in the post genomic era, chalmers reproservice, goteborg, pp. 85-95. Gnaiger, e. Kuznetsov, a.V. Schneeberger, s. Seller, r. Brandacher, g. Steurer, w. Margreiter, r. 2000. Митохондрии в холоде. В: heldmaier, g. Klingenspor, m. (Eds.), Life in the cold. Springer, heidelberg, berlin, new york, pp. 431-442. Haas, r.H. Parikh, s. Falk, m.J. Saneto, r.P. Wolf, n.I. Darin, n. Wong, l.J. Cohen, b.H. Naviaux, r.K. 2008. Углубленная оценка подозрения на митохондриальное заболевание. Mol genet metab 94,16-37. Hauptmann, s. Keil, u. Scherping, i. Bonert, a. Eckert, a. Muller, w.E. 2006. Митохондриальная дисфункция при спорадической и генетической болезни альцгеймера. Experimental gerontology 41, 668-673. Hutter, e. Unterluggauer, h. Garedew, a. Jansen-durr, p. Gnaiger, e. 2006. Респирометрия высокого разрешения — современный инструмент в исследованиях старения. Experimental gerontology 41,103-109. Johannsen, d.L. Ravussin, e. 2010. Ожирение у пожилых людей: виноват ли в этом неправильный метаболизм? Aging health 6,159-167. Kilkson, h. Holme, s. Murphy, s. 1984. Метаболизм тромбоцитов при хранении концентратов тромбоцитов при 22 градусах с. Blood 64, 406-414. Kitchens, c.S. Newcomb, t.F. 1968. Дыхание тромбоцитов человека. J appl physiol 25, 581-585. Kones, r. 2010. Болезнь паркинсона: молекулярная патология митохондрий, воспаление, статины и лечебное нейропротекторное питание. Nutr clin pract 25, 371-389. Krige, d. Carroll, m.T. Cooper, j.M. Marsden, cd. Schapira, a.H. 1992. Тромбоцитарная митохондриальная функция при болезни паркинсона. The royal kings and queens parkinson disease research group. Ann neurol 32, 782-788. Kuznetsov, a.V. Strobl, d. Ruttmann, e. Konigsrainer, a. Margreiter, r. Gnaiger, e. 2002. Оценка дыхательной функции митохондрий в малых биоптатах печени. Anal biochem 305,186-194. Lemieux, h. Semsroth, s. Antretter, h. Hofer, d. Gnaiger, e. 2011. Митохондриальный контроль дыхания и ранние дефекты окислительного фосфорилирования в отказывающем человеческом сердце. Intj biochem cell biol 43,1729-1738. Lenaz, g. Genova, m.L. 2009. Структурно-функциональная организация митохондриальной дыхательной цепи: динамическая суперсборка. Int j biochem cell biol 41,1750-1772. Lesnefsky, e.J. Hoppel, c.L, 2006. Окислительное фосфорилирование и старение. Старение исследовательские обзоры 5, 402-433. Merlo pich, m. Bovina, c, formiggini, g. Cometti, g.G. Ghelli, a. Parenti castelli, g. Genova, m.L. Marchetti, m. Semeraro, s. Lenaz, g. 1996. Ингибиторная чувствительность дыхательного комплекса i в тромбоцитах человека: возможный биомаркер старения. Febs lett 380,176-178. Nicholls, d.G. 1977. Эффективная протонная проводимость внутренней мембраны митохондрий из коричневой жировой ткани. Зависимость от градиента протонного электрохимического потенциала. Eur j biochem 77, 349-356. Nulton-persson, a.C. Szweda, l.I. 2001. Модуляция митохондриальной функции перекисью водорода. The journal of biological chemistry 276, 23357-23361. Picard, m. Taivassalo, t. Gouspillou, g. Hepple, r.T. 2011. Mitochondria: isolation, structure and function. J physiol. Rasmussen, u.F. Krustrup, p. Kjaer, m. Rasmussen, h.N. 2003a. Экспериментальные доказательства против митохондриальной теории старения. Исследование изолированных митохондрий скелетных мышц человека. Экспериментальная геронтология 38, 877-886. Rasmussen, u.F. Krustrup, p. Kjaer, m. Rasmussen, h.N. 2003b. Митохондриальный метаболизм скелетных мышц человека в молодости и в старческом возрасте: отсутствие признаков функциональных изменений в образовании атф и окислительной способности митохондрий. Pflugers archiv : european journal of physiology 446, 270-278. Rosenstock, t.R. Duarte, a.I. Rego, a.C. 2010. Митохондриально-ассоциированные метаболические изменения и нейродегенерация при болезни хантингтона — от клинических признаков к лабораторным исследованиям. Curr drug targets 11,1218-1236. Rossignol, r. Faustin, b. Rocher, c, malgat, m. Mazat, j.P. Letellier, t. 2003. Пороговые эффекты митохондрий. Biochem j 370, 751-762. Sjovall, f. Morota, s. Hansson, m.J. Friberg, h. Gnaiger, e. Elmer, e. 2010. Сепсис вызывает расцепление митохондрий тромбоцитов и постепенное увеличение дыхательной емкости, что отрицательно связано с клиническим исходом. Critical care 14, p:ll. Tonkonogi, m. Fernstrom, m. Walsh, b. Ji, l.L. Rooyackers, o. Hammarqvist, f. Wernerman, j. Sahlin, k. 2003. Снижение окислительной мощности, но неизменная антиоксидантная способность в скелетных мышцах пожилых людей. Pflugers archiv : european journal of physiology 446, 261-269. Vendelbo, m.H. Nair, k.S. 2011. Митохондриальные пути долголетия. Biochimica et biophysica acta 1813, 634-644. Xu, j. Shi, c, li, q. Wu, j. Forster, e.L, yew, d.T. 2007. Митохондриальная дисфункция в тромбоцитах и гиппокампе мышей с ускоренным старением. J bioenerg biomembr39,195-202. Yamori, y. 2006. Пищевые факторы для профилактики атеросклероза: азиатская перспектива на основе анализа мировых диетических биомаркеров. Экспериментальная иклиническая кардиология 11, 94-98. Yanicostas, c, soussi-yanicostas, n. El-khoury, r. Benit, p. Rustin, p. 2011. Developmental aspects of respiratory chain from fetus to infancy. Seminars in fetal & neonatal medicine 16,175-180.<br>Если у вас есть вопросы о том, где и как использовать днп заказать, вы можете обратиться к нам на веб-страницу.<br><br><br>

[Автор]

Сообщения